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    細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。

二、試劑與儀器

1、孵育緩沖液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2

2、標記液：將FITC- Annexin V（寶靈曼公司產(chǎn)品）和PI加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1ug/ml

3、流式細胞儀

三、實驗步驟

1、細胞收集：懸浮細胞直接收集到10ml的離心管中，每樣本細胞數(shù)為（1~5）×106，/mL　500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。

2、用孵育緩沖液洗滌1次，500~1000r/min離心5min。

3、用100ul的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10~15min。

4、500~1000r/min離心5min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。

5、加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動。

6、流式細胞儀分析：流式細胞儀激發(fā)光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI。

7、結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。